Терминът MALDI (матрикс асистирана лазерна десорбционна йонизация) се появява в средата на 80-те години, когато група учени демонстрират йонизиране на аланин при облъчване с лазер в присъствие на триптофан [1]. Силно поглъщащият триптофан има опосредствяваща функция към достигане на крайната цел – йонизиране на аланина – и по този начин изпълнява ролята на йонизиращ матрикс.

С този подход успешно са били йонизирани ниско-молекулни пептиди, но само две години по-късно той разкрива потенциала си пред биолозите с изследванията на Koichi Tanaka и съавтори [2]. Tanaka успява да йонизира 34-килодалтоновата карбоксипептидаза-А, с което бариерата на високомолекулните съединения е прескочена и MALDI заявява присъствието си в протеомиката.

Оттогава до днес биоинформатиката работи активно за създаване на алгоритми и имплементирането им в приложения за бързо и обемно идентифициране и секвениране на белтъци чрез интерпретация на сурови данни от масспектроскопски изследвания.

Въпреки големия брой от разновидности на масспектрометри и немалките различия в тяхното устройство, практически всички инструменти се основават на прост физичен принцип.

Изходната точка на всяко изследване е йонният източник на инструмента – мястото, където пробата се поставя и йонизира след въздействие. След прилагане на електрично поле йоните се ускоряват във вакуум, след което с висока скорост навлизат в среда с приложено магнитно поле. Магнитното поле упражнява сила върху заредените частици и по този начин повлиява на движението им (например на траекторията им). Съгласно Втория принцип на Нютон, отклонението е пропорционално на тяхната маса: по-леките йони се отклоняват по-лесно спрямо по-тежките:


F е силата, която действа върху йона, m – неговата маса, a – ускорението, q – заряд на йона, E – електричното поле, а v x B е векторното произведение от скоростта на йона и магнитното поле. От горните две уравнения директно следва:


Отношението маса/заряд (m/q) е именно този параметър, който инструментът мери в своя анализатор за йон със заряд q, ускорен в електрично поле E и попаднал в магнитно поле B. Пътят, който всеки йон изминава в тези условия, зависи пряко от стойността на неговото m/q.


Фиг. 1: Схематично устройство на масспектрометър. (а)Линеен режим – част от молекулите на пробата преминават в газова фаза под действие на лазер, след което се ускоряват в електрично поле. Времето, за което те пропътуват последващата свободна от поле зона зависи от стойността на отношението маса/заряд за всеки йон; (б)Рефлекторен режим – в допълнение към линейния режим, йоните се фокусират върху детектора от рефлектрон. По този начин се повишава разделителната способност.
Третият съществен елемент от апарата е детекторът, който измерва интензивността на сигнала за всеки установен m/q вид.

Масспектрометрите се различават съществено един от друг по два показателя: 1) начин на йонизиране на пробата; 2) вид на анализатора. Когато говорим за MALDI-TOF [3]:

Секвениране с MALDI-TOF

Преди да бъдат анализирани с MALDI-TOF, протеините се разделят с помощта на двумерна електрофореза (или HPLC), изрязват се от гела и се смилат с протеолитичен ензим (трипсин) до пептиди. Пептидите трябва да ко-кристализират с молекулите на матрицата, преди да бъдат внесени в инструмента.
Когато пептидите попаднат във фрагментиращия модул на хибридния инструмент, индуцира се тяхното фрагментиране, при което се получава профил от различни по дължина йони, предимно носещи заряд 1+. Съгласно предложената номенклатура [4], йоните са класифицирани в 6 вида: a, b, c, x, y, и z. От тях най-често наблюдавани са a, b и y.

Фиг. 2: Номенклатура за означаване на йоните, получени при фрагментация.

Йоните от тип b стартират от азотния край на пептида и продължават към въглеродния край с нарастваща маса, като b1 кореспондира с първата аминокиселина от пептида; y йоните – обратно, като y1 съответства на последната аминокиселина. Йоните от тип a са по-редки и се появяват в корелация с b йоните, като обикновено се използват като подкрепящо свидетелство за наличието на спрегнатите им b йони.

Фрагментацията не настъпва последователно, остатък по остатък, а по-скоро в произволни точки от пептидите. Профилът от пикове, който се наблюдава в един MS/MS спектър, отразява както цялата съвкупност от йони, получени в хода на очакваната фрагментация, така и на допълнителни фрагментационни събития в следствие от молекулни сблъсъци, загуба на вода и др. При всички случаи в един качествен спектър би следвало ясно и в най-голямо количество (над определена базова линия от шум) да присъстват b- и y-серии от йони. Веднъж попаднал в пик, който е част от b или y серия от спектъра, изследователят започва стъпаловидно да изчислява масовата разлика между текущия йон (например y1) и неговия съсед в MS/MS спектъра (y2). Два съседни йона от една серия се различават точно с масата на една аминокиселина – тази масова разлика приема такова количествено измерение, каквато е масата на конкретната аминокиселина.

В спектри с добро качество този процес се повтаря стъпаловидно до достигане на последния йон от серията, след което цялата процедура може да бъде повторена с алтернативната серия от йони (b1 до bn) – за валидиране на резултатите от първия прочит.

Разчитането на спектрите се подчинява още на следните правила:


( M + H )1+ - y1+1 = b


--
Иван Калев

1. Karas, M.; Bachmann, D.; Hillenkamp, F. (1985). Influence of the Wavelength in High-Irradiance Ultraviolet Laser Desorption Mass Spectrometry of Organic Molecules. Anal. Chem. 57: 2935-9
2. Tanaka, K.; Waki, H.; Ido, Y.; Akita, S.; Yoshida, Y.; Yoshida, T. (1988). Protein and Polymer Analyses up to m/z 100 000 by Laser Ionization Time-of flight Mass Spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom 2 (20): 151-3
3. Wollniк, H. (1993). Time-of-flight mass analyzers. Mass Spectrometry Reviews 12: 89-114
4. Roepstorff, P.; Fohlman, J. (1984). Proposal for a common nomenclature for sequence ions in mass spectra of peptides. Biomed Mass Spectrom. 11 (11): 601