Мезенхимните стволови клетки (МСК) са млади клетки, които се намират в различни тъкани на възрастния организъм и са способни да регенерират дадената тъкан, от където идва и големия интерес към тях. Те се изолират най-лесно от костен мозък. МСК са описани за първи път през 60-те и 70-те години на 20- ти век от Alexander Friedenstein et.al (1974 - Stromal cells responsible for transferring the microenvironment of the hematopoietic tissues. Transplantation. 17:331). Той и неговите колеги откриват, че в костния мозък има клетки, които адхезират върху съда за култивиране. При подходящи условия на култивиране (ниска плътност на клетките, подходяща среда) се получава култура от вретеновидни фибробластни клетки. Тях те означили като колония-формиращи единици-фибробласти (CFU-F), след което доказали, че имат свойството да се самообновяват неограничено дълго.

Установено е също, че тези клетки се причисляват към рядка популация от клетки в костния мозък, преминават в S фаза на клетъчния цикъл след повече от 60 ч от началото на култивиране, притежават висок репликативен капацитет in vitro и формират колонии с неопределена форма и плътност. Експериментите са показали, че тази клетъчна линия може да формира костна тъкан in vivo, дори след продължително култивиране. След изолиране МСК могат да бъдат отглеждани in vitro само няколко пасажа след което се диференцират в клетки на някои мезенхимни тъкани като остеобласти, хондроцити, адипоцити, миоцити, теноцити, хематопоетично-поддържащи стромални клетки и формират костно- и хрущялоподобни колонии. Култивирането на костно мозъчни култури разкрива наличието на адхерентни стромални клетки, които поддържат хематопоетичния компонент, играейки ролята на подхранващ слой. След като ендотелните клетки, моноцитите и лимфоцитите са премахнати чрез негативна имуноселекция, получените култури се състоят от стромални клетки, които имат характеристики на остеобластни и адипоцитни линии, по този начин се предполага техният статус на предшественик на тези клетъчни линии.

Благодарение на тяхната честота в стромата на костния мозък, често тези клетки се означават като стромални мезенхимни клетки, въпреки че се съдържат и в самия костен мозък с честота 0.001-0.01% от всички ядрени клетки. Стромалните клетки играят важна роля като микросреда за подпомагането на развиващите се хематопоетични стволови и прогениторни клетки в костния мозък. Мезенхимни стволови клетки са изолирани също и от периостеум, трабекуларни кости, мастна тъкан, синовиум, скелетни мускули, бели дробове, млечни зъби. Има научни доказателства, че МСК могат да циркулират в кръвната плазма. При човек МСК се изолират от костен мозък на гръбначните прешлени, както и от тибиата и фемура, гръден и лумбален гръбначен стълб. В по-големите животни, костният мозък се изолира от същите места, а при гризачи – основно от медиафиза на тибиа или фемура. Отделеният костен мозък се обработва с високоградиентно центрофугиране, за да се изолира фракция от мононуклеарни клетки. Получената утайка се ресуспендира в подходяща хранителна среда и клетъчната суспензия се засява в матрак със среда, обогатена с телешки серум (FBS). За да се отстранят останалите неадхерентни клетки след 24- до 72 ч се сменя средата, а след първото пасажиране се смята, че популацията се изчистват и от останалите адхерентни мононуклеарни клетки.

Една от най-важните характеристики при култивиране на МСК е правилното подбиране на количеството на серум, от което следва: (1) селективно прикрепване на МСК върху матраците за култивиране, (2) митотична експанзия на МСК и (3) издръжливост на МСК фенотип. Обогатяването на CFU-F или повишаване на тяхната честота, сравнено с цялостното костно мозъчно култивиране, може да бъде постигнато чрез негативна имуноселекция (CD34+/CD11b+/CD31+ cell depletion) или чрез позитивна имуноселекция, при която се използват антитела срещу Stro-1, CD49a, D7-FIB и LNGFR (low-affinity nerve growth factor receptor). Моноклоналните антитела като анти- Stro-1 и HOP-26 е доказано, че обогатяват остеопрогениторните клетки в култура на костен мозък. Други протоколи доказват възможността да се генерира хомогенна популация от МСК, чрез подхранване на инициалната култура костномозъчни клетки с един или повече растежни фактори като TGF-β1, bFGF (basic fibroblast growth factor), EGF (epidermal growth factor), PDGF (platelet derived growth factor). Например, докато bFGF поддържа устойчивостта на на диференциращата способност на МСК за различни клетъчни линии, комбинацията от цитокини като kit-ligand, тромбопоетин, IL-3, IL-11 не доказват подпомагащата роля на МСК за хематопоетични клетки в дълго култивирани костномозъчни култури.

Съществуват и други начини на изолиране. Например, някои лаборатории използват различната чувствителност на МСК и другите костномозъчни клетки на екстрацелуларно действащи фактори, например АТФ-йони. МСК са с нечувствителни мембрани, докато макрофагите и хематопоетичните клетки на костния мозък са чувствителни на големи концентрации извънклетъчни АТФ йони като в областта на навлизане на тези йони се образуват мембранни лезии. Слабо пролиферативни популации на МСК могат да се изолират от силно пролиферативни чрез индуциране на смърт в пролифериращи клетки, в резултат на третирането на културата с 5-флуороурацил.

Най- добрите методи за точната изолация на хомогенна МСК култура са Flow–цитометър, FACS (fluorescence-activated cell sorting), MACS (magnetic-associated cell sorting) от тъкан, но е необходимо време за определяне на най-подходящите маркери за тяхното детектиране.

МСК се култивират подобно на всички адхезионни култури – в матрак в хюмидифициран инкубатор, съдържащ 5% СО2 и на 370С. Средата е най-често ДМЕМ или α-МЕМ с висока или ниска концентрация на глюкоза.
При култивиране без допълнителни диференционни фактори, МСК развиват фибробластно-подобна морфология. След засяването им с ниска плътност, те формират колонии. В този случай lag-фазата е приблизително по-дълга (3-5 дни) и е последвана от фаза на бърз, експоненциален растеж. Стационарното състояние на културите е свързано с известно намаляване на клетъчната пролиферация. Тази кинетика на растеж се осъществява за 4-5 пасажа. При човешки МСК е установено, че преминаването от lag-фаза в експоненциален растеж е свързано с акумулирането на инхибитор на Wnt-сигнални пътища, който е добавен в средата.

МСК демонстрират добър пролиферативен потенциал и техните култури претърпяват от 8 до 50 пасажирания, в някои случаи дори 60. Въпреки това МСК остаряват сравнително бързо, поради скъсяване на теломерите им, което се дължи на липсата на ензимна активност на тяхната теломераза.

Функционално МСК се характеризират с време на делене 33ч. Те имат голям потенциал за самообновяване. Установено е, че приблизително 20% от клетките в култура на МСК са непролифериращи клетки. Предполага се, че поддържането на постоянното им количество има значение за поддържане на стационарно състояние на количеството на клетките, способни да диференцират в нехематопоетични тъкани.

Пролиферационната активност на МСК зависи от някои хуморални фактори. Степента на клетъчния растеж се повишава от EGF (epidermal growth factor) и FGF-4 (fibroblast growth factor). bFGF (basic fibroblast growth factor) е важен регулатор за МСК, той едновременно индуцира пролиферацията на културата и повишава продължителността на живота и предпазва техния диференциационен потенциал при многократно пасажиране.

Повърхностни маркери

През последните години се наблюдава голям изследователски интерес към откриването на специфични повърхностни маркери за МСК, за да може да се осъществява бъдещо тяхно идентифициране. Проблемът на МС клетъчни маркери е, че те все още са изучавани само след като клетките са култивирани in vitro. Друг проблем е, че техни експресивни характеристики се припокриват с тези на фибробластни линии (експресия на матриксни протеини), на ендотелни клетки (endoglin и MUC-18), както и на епителни и мускулни клетки (a-smooth muscle actin).

Първоначално са открити 3 антитела: SH2, SH3, SH4, които разпознават повърхностно-маркерни антигени на МСК и не разпознават маркери върху хематопоетични клетки в костния мозък, остеобласти и остеоцити. SH2 е моноклонално антитяло, което разпознава CD105 (endoglin) и TGF-βRIII. Вторият маркер основно се асоциира с ендотелната тъкан. CD105 (endoglin) играе важна роля в хондрогеничната диференциация на МСК в костен мозък, докато TGF-βRIII основно се асоциира с ендотелната тъкан. SH3и SH4 разпознават различни епитопи на CD73 по повърхността на МСК. CD73 е мембранно свързан протеин , който участва в сигналните пътища.

STRO-1 е антитяло, което реагира с нехематопоетични костно мозъчни стволови клетки. Flow-Cytometric анализ на експресията на антигена на STRO-1 доказва повишаване на STRO-1-позитивни клетки след втората седмица култивиране, последвано от прогресивно намаляване. Предполага се, че загубата на експресия на STRO-1 при продължително култивиране се дължи на in vitro зреенето на стромални прекурсори в повече диференцирани стромално клетъчни типове. Малка част от STRO-1-позитивните клетки остават при продължително култивиране и са способни да продуцират адхерентни клетъчни слоеве, които са неразличими от възрастните култури.

МСК са позитивни за следните повърхностни маркери: CD9, CD10, CD13, CD29, CD44, CD49a, CD49b, CD49c, CD49e, CD58, CD61, CD71, CD73, CD90, CD102, CD104, CD105, CD106, CD119, CD120a, CD120b, CD121, CD123, CD124, CD126, CD127, CD140a, CD166;

МСК не експресират типичните хематопоетични антигени: CD45, CD34, CD133, CD14, CD11b и ендотелния маркер CD314.

Интегрини, експресирани от МСК:
CD29 VLA-beta chain; beta-1 integrin chain
CD49a Alpha-1 integrin chain; VLA-1 alpha chain
CD49b Alpha-2 integrin chain; GPIa; VLA-2 alpha chain
CD49c Alpha-3 integrin chain; VLA-3 alpha chain
CD49e Alpha-5 integrin chain; FNR alpha chain; VLA-5 alpha chain
CD104 beta 4 integrin chain; TSP-1180; beta 4

Интерлевкинови рецептори и рецептори на растежни фактори, които се експресират от мезенхимни стволови клетки :
CD121 IL-1R
CD123 IL-3Ralpha
CD124 IL-4R
CD126 IL-6R
CD127 IL-7R; IL-7R alpha; p90 Il7 R
CD140a PDGF-R

Има наблюдения, че МСК експресира in vivo някои хематопоетични и други маркери. Една от субпопулациите на МСКи, която е наблюдавана е съставена от бързо самовъзстановяващи се клетки, които са малки на размер, имат висока митотична активност и могат да бъдат обогатени в култура дори при много ниска концентрация на посяване. Тази популация се определя по експресията на определени маркери, в това число TrkA, Flk-1 и c-kit рецептори.